Spektrofotometri er en eksperimentell teknikk som brukes til å måle konsentrasjonen av et oppløst stoff i en bestemt løsning ved å beregne mengden lys som absorberes av stoffet. Denne teknikken er veldig nyttig fordi visse forbindelser også vil absorbere forskjellige bølgelengder av lys ved forskjellige intensiteter. Ved å analysere lyset som passerer gjennom en løsning, kan du identifisere forbindelsene oppløst i løsningen og deres konsentrasjoner. Verktøyet som brukes til å analysere løsninger med denne teknikken i laboratoriet er et spektrofotometer.
Steg
Del 1 av 3: Klargjøre prøven
Trinn 1. Slå på spektrofotometeret
De fleste spektrofotometre må varmes opp før de kan gi nøyaktige målinger. Så start maskinen og la den sitte i minst 15 minutter før du måler prøven.
Bruk denne tiden til å forberede prøven
Trinn 2. Rengjør kyvetten eller reagensrøret
I skolelaboratorier kan det være tilgjengelig engangsprøverør som ikke må rengjøres først. Hvis du bruker en vanlig kuvett eller reagensrør, må du imidlertid rengjøre apparatet grundig før bruk. Skyll alle kyvetter med avionisert vann.
- Vær forsiktig med å bruke kuvetter, da de er ganske dyre.
- Når du bruker kuvetten, må du ikke berøre siden der lyset passerer (vanligvis den klare siden av beholderen).
Trinn 3. Hell tilstrekkelig prøve i kyvetten
Det maksimale volumet til en del av kyvetten er 1 ml, mens det maksimale volumet på reagensrøret er 5 ml. Målingene dine skal være nøyaktige så lenge spektrofotometerets lys fortsatt kan passere gjennom prøven og ikke en tom del av beholderen.
Hvis du bruker en pipette til å sette inn prøver, bruker du et nytt tips for hver prøve. På den måten kan krysskontaminering unngås
Trinn 4. Forbered kontrollløsningen
Disse løsningene som også er kjent som emner eller emner inneholder bare løsningsmidlet i løsningen som analyseres. For eksempel, hvis du har en prøve av salt oppløst i vann, er den tomme løsningen du trenger vann. Hvis vannet du bruker er rødt, bør du også bruke en rød blank løsning. Bruk en lignende beholder for å holde den tomme løsningen i samme volum som prøven.
Trinn 5. Tørk utsiden av kyvetten
Før du setter kuvetten inn i spektrofotometeret, må du sørge for at den er ren for å unngå forstyrrelser i målingene på grunn av støvpartikler eller urenheter. Bruk en lofri klut til å fjerne vanndråper eller støv som fester seg på utsiden av kyvetten.
Del 2 av 3: Eksperimentering
Trinn 1. Bestem og juster lysets bølgelengde for å analysere prøven
Bruk en enkelt bølgelengde av lys (monokromatisk stråle) for å øke måleeffektiviteten. Velg lysfargen som kan absorberes av det kjemiske innholdet som antas å være oppløst i testprøven. Still inn bølgelengden i henhold til spesifikasjonene til spektrofotometeret du bruker.
- I skolelaboratorier vil disse bølgelengdene vanligvis angis i eksperimentelle instruksjoner.
- Fordi prøven vil reflektere alt synlig lys, er bølgelengden til det eksperimentelle lysets farge vanligvis alltid forskjellig fra prøvens farge.
- Et objekt viser en bestemt farge fordi det reflekterer en bestemt bølgelengde og absorberer alle andre farger. Gresset ser grønt ut fordi klorofyllet i det reflekterer grønt og absorberer andre farger.
Trinn 2. Kalibrer spektrofotometeret med en blank løsning
Plasser den tomme løsningen i kyvetteholderen og lukk spektrofotometeret. På den analoge spektrofotometerskjermen er det en nål som vil bevege seg basert på intensiteten til lysdeteksjon. Etter at den tomme løsningen er satt inn, skal nålen bevege seg til høyre. Registrer denne verdien hvis du trenger den senere. La den tomme løsningen forbli i spektrofotometeret, og skyv deretter nålen til null ved hjelp av justeringsknappen.
- Digitale spektrofotometre kan også kalibreres på samme måte. Dette verktøyet er imidlertid utstyrt med en digital skjerm. Sett avlesningen av den tomme løsningen til 0 med kontrollknappen.
- Selv om den tomme løsningen fjernes fra spektrofotometeret, vil kalibreringen fortsatt være gyldig. Så når du måler hele prøven, vil absorbansen til emnet automatisk reduseres.
Trinn 3. Fjern emnet og test kalibreringsresultatene for spektrofotometeret
Selv etter at den tomme løsningen er fjernet fra spektrofotometeret, bør nålen eller nummeret på skjermen fortsatt være 0. Sett den tomme løsningen tilbake i spektrofotometeret og sørg for at avlesningen ikke endres. Hvis spektrofotometeret er riktig kalibrert ved bruk av en blank løsning, bør resultatet på skjermen fortsatt være 0.
- Hvis nålen eller tallet på skjermen ikke viser 0, gjentar du kalibreringstrinnene med en blank løsning.
- Hvis problemet vedvarer, søk hjelp eller få noen til å sjekke spektrofotometeret.
Trinn 4. Mål absorbansen til prøven
Fjern den tomme løsningen og sett prøven inn i spektrofotometeret. Vent omtrent 10 sekunder før hendene stabiliserer seg, eller tallene på det digitale displayet slutter å endre seg. Registrer den prosentvise transmittansen og/eller absorbansen av prøven.
- Jo mer lys som passeres, jo mindre lys absorberes. Vanligvis må du registrere absorbansverdien til prøven som vanligvis uttrykkes som et desimaltall, for eksempel 0,43.
- Gjenta målingen av hver prøve minst tre ganger og beregne gjennomsnittet. På den måten blir resultatene du får mer nøyaktige.
Trinn 5. Gjenta eksperimentet med forskjellige bølgelengder av lys
Prøven din kan inneholde flere forbindelser som har forskjellige absorbanser avhengig av lysets bølgelengde. For å redusere usikkerheten gjentar du målinger av prøver med 25 nm bølgelengdeintervaller over lysspekteret. På denne måten kan du oppdage andre oppløste kjemikalier i prøven.
Del 3 av 3: Analyse av absorbansdata
Trinn 1. Beregn prøvens transmittans og absorbans
Transmittansen er hvor mye lys som kan passere gjennom prøven og nå spektrofotometeret. I mellomtiden er absorbans hvor mye lys som absorberes av en av de oppløste kjemikaliene i prøven. Det er mange moderne spektrofotometre som gir utgang i form av transmittans og absorbans. Men hvis du får en lysintensitetsverdi, kan du også beregne disse to verdiene selv.
- Transmittansen (T) kan bestemmes ved å dividere intensiteten av lys som passerer gjennom prøveoppløsningen med mengden lys som passerer gjennom den tomme løsningen. Denne verdien er vanligvis uttrykt som et desimalnummer eller en prosentandel. T = I/I0, hvor jeg er prøveintensiteten og jeg0 er den tomme intensiteten.
- Absorbans (A) uttrykkes som en negativ base 10 logaritme (eksponent) transmittans: A = -log10T. Så, hvis T = 0, 1, A = 1 (0, 1 er 10 til effekten -1). Dette betyr at 10% av lyset passeres, mens 90% absorberes. I mellomtiden, hvis T = 0,01, A = 2 (0,01 er 10 til effekten -2). Dette betyr at lyset som passeres er 0,1%.
Trinn 2. Graf absorbansverdien kontra bølgelengden
Uttrykk absorbansverdien som y-aksen og bølgelengden som x-aksen. Fra prikkene til alle absorbansresultater i hver bølgelengde får du absorbansspekteret til prøven og identifiserer innholdet i forbindelsen og forholdet i prøven.
Absorbansspektra har vanligvis topper ved visse bølgelengder. Disse toppbølgelengdene lar deg identifisere spesifikke forbindelser
Trinn 3. Sammenlign absorbansspekteret med en graf over en kjent forbindelse
Hver forbindelse har et unikt absorbansspekter og har alltid den samme toppbølgelengden i hver måling. Ved å sammenligne grafen du får med en graf over en bestemt kjent forbindelse, kan du identifisere oppløsningsinnholdet i prøveoppløsningen.
