Gramfarging er en rask teknikk og brukes til å se tilstedeværelsen av bakterier i en vevsprøve og for å klassifisere bakteriene som gram-positive eller gram-negative, basert på de kjemiske og fysiske egenskapene til celleveggene. Gramfarging brukes nesten alltid som det første trinnet i diagnostisering av en bakteriell infeksjon.
Denne fargeteknikken er oppkalt etter den danske forskeren Hans Christian Gram (1853 - 1938), som utviklet teknikken i 1882 og publiserte den i 1884 som en teknikk for å skille mellom to typer bakterier med lignende kliniske symptomer: Streptococcus pneumoniae (også kjent som Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) og bakterien Klebsiella pneumoniae.
Steg
Metode 1 av 3: Klargjøring av objektglasset
Trinn 1. Forbered deg på å arbeide i laboratoriet
Bruk hansker og et langt hår slips for å forhindre bakteriell forurensning av prøven du tester. Rengjør arbeidsområdet under avtrekkshette eller i et annet godt ventilert område. Kontroller Bunsen -brenneren og kontroller at mikroskopet fungerer som det skal før du starter.
Trinn 2. Steriliser objektglasset av mikroskop
Hvis glassplaten er skitten, vask den med såpevann for å fjerne olje og smuss. Rengjør objektglassene med etanol, glassrenser eller en annen metode som brukes av laboratoriet ditt.
Trinn 3. Legg prøven på glassplaten
Du kan bruke Gram -fargeteknikken til å identifisere bakterier i en medisinsk prøve, eller en kultur av bakterier som vokser i en petriskål. For best resultat, bruk Gram -flekk på tynne streker av prøven. Det er tilrådelig å bruke prøver som er mindre enn 24 timer gamle, ettersom eldre bakterier kan ha skadet celleveggene og ikke svare på Gram -farging.
- Hvis du bruker en vevsprøve, tilsett 1-2 dråper til et glassrute. Spred jevnt på objektglasset for å danne et tynt lag med prøvesprinkling ved å skyve det ved hjelp av kanten på det andre sterile glassglasset. La det tørke før du gjør neste trinn.
- Hvis du tar bakterier fra en petriskål, steriliser inokulasjonssløyfen i en Bunsen -brenner til den lyser, og la den avkjøle. Bruk løkken til å dryppe sterilt vann på objektglasset, steriliser deretter og avkjøl igjen før du bruker den til å samle en liten prøve av bakterier. Etter det røres forsiktig.
- Bakteriene som er tilberedt i buljongen må omrøres igjen ved hjelp av en vortexer, deretter tas med inokulasjonssløyfen som ovenfor, uten å tilsette vann.
- Hvis du har en vattpinneprøve (vanligvis utført med et lite håndtak med bomullstopp), berører du og roterer vattpinnen forsiktig over lysbildet.
Trinn 4. En litt høy temperatur kan gjøre en god flekk
Varmen vil holde bakteriene på toppen av lysbildet, slik at de ikke løser seg lett under fargingsprosessen. Bank raskt på lysbildet to til tre ganger over en Bunsen -brenner, eller varm lysbildet over en elektrisk lysbildevarmer. Ikke overopphet, prøven kan bli skadet. Hvis du bruker en Bunsen -brenner, bør den være en liten, men blå flamme i stedet for en stor oransje flamme.
Alternativt kan det også gjøres et utstryk med metanol ved å tilsette 1-2 dråper metanol til et tørt utstryk, tørke den gjenværende metanolen på objektglasset ved å la den stå i friluft. Denne teknikken minimerer celleskader og gir en ren lysbildebakgrunn
Trinn 5. Plasser lysbildet over fargebakken
Fargebrett er laget av metall-, glass- eller grunne plastplater med et mykt mesh som fôrer toppen. Legg objektglassene oppå disse garnene, slik at væsken du bruker kan tappes ut i brettet.
Hvis du ikke har et fargebakke, kan du plassere et lysbilde på et plastbrett for å skrive ut isbiter
Metode 2 av 3: Gram Stain Process
Trinn 1. Hell den krystallfiolette væsken over smøret
Bruk en pipette til å spraye en prøve av bakterier med noen dråper krystallfiolett fargestoff, også kjent som gentianfiolett. La den stå i 30-60 sekunder. Krystallfiolett (KV) separeres i vandig oppløsning i KV+ og klorid (Cl-) ioner. Disse ionene trenger inn i celleveggene og cellemembranene til både grampositive og gramnegative bakterier. KV+ -ionet interagerer med de negativt ladede komponentene i bakteriecellene, og gir cellene en lilla farge.
Mange laboratorier bruker "Hucker" krystallfiolett, som inneholder ammoniumoksalat for å forhindre nedbør
Trinn 2. Skyll krystallfiolett forsiktig
Vipp objektglasset og bruk en vaskeflaske for å sprøyte en liten strøm destillert eller vann fra springen over lysbildet. Vann skal renne ned over overflaten av flekket, og bør ikke sprøytes direkte på flekket. Ikke skyll for mye. Det kan fjerne flekker i grampositive bakterier.
Trinn 3. Skyll smøret med jod, og skyll deretter
Bruk en dråpe for å skylle smøret med jod. La den stå på i minst 60 sekunder, og skyll deretter forsiktig på samme måte som ovenfor. Jod, i form av et negativt ladet ion, interagerer med KV+ for å danne et stort sammensatt kompleks mellom krystallfiolett og jod (CV-I-sammensatt kompleks) i cellens indre og ytre lag. Dette komplekset av forbindelser vil beholde den fiolette fargen til krystallfioletten inne i cellen, på de flekkete stedene.
Jod er et etsende stoff. Unngå innånding, svelging eller hudkontakt
Trinn 4. Tilsett blekemiddel, og skyll deretter av raskt
En 1: 1 blanding av aceton og etanol brukes vanligvis til dette viktige trinnet, som må være nøye tidsbestemt. Plasser lysbildet i en viss vinkel, og tilsett deretter fargeblekkemiddel til det ikke er mer lilla synlig i vannet som brukes til skylling. Dette tar vanligvis mindre enn 10 sekunder, eller enda mindre tid hvis blekemiddelet inneholder en høy konsentrasjon av aceton. Stopp dette trinnet umiddelbart, ellers vil fargestoffet også lekke ut krystallfiolett fra de gram-positive og negative cellene, og fargeprosessen må gjentas. Skyll umiddelbart av overflødig fargeblekkemiddel med den forrige teknikken.
- Ren aceton (95%+) kan brukes som erstatning. Jo mer aceton du bruker, jo raskere virker blekemidlet, så du må være mer oppmerksom på timingen.
- Hvis du har problemer med å holde oversikt over tidspunktet for dette trinnet, kan du legge til farge blekemiddel dråpe for dråpe.
Trinn 5. Dryss motfargestoffet over smeten, og skyll deretter
En motflekk, vanligvis safranin eller fuchsin, brukes til å øke kontrasten mellom gramnegative og grampositive bakterier, ved å farge avfargede (avfargede) bakterier, dvs. gramnegative bakterier, rosa eller røde. La stå i minst 45 sekunder, skyll deretter.
Fuchsin vil intensivt flekke mange gramnegative bakterier, for eksempel Haemophilus spp og Legionella spp. Denne metoden er bra for nybegynnere
Trinn 6. Tørk lysbildet
Du kan tørke dem i friluft for å tørke, eller tørke dem med papir som selges til dette formålet. Gramfarging er fullført.
Metode 3 av 3: Kontroll av fargresultatene
Trinn 1. Forbered lysmikroskopet
Plasser lysbildet under mikroskopet. Bakterier varierer veldig i størrelse, så den totale forstørrelsen som kreves vil variere fra 400x til 1000x. Et objektiv med nedsenkingsolje anbefales for et skarpere bilde. Slipp nedsenkingsoljen på objektglasset, unngå bevegelse mens det drypper for å forhindre at det dannes bobler. Flytt mikroskoplinsens håndtak slik at objektivet klikker på plass og berører oljen.
Nedsenkning av olje kan bare brukes på spesialdesignede linser, ikke på "tørre" linser
Trinn 2. Prøv å identifisere grampositive og gramnegative bakterier
Undersøk lysbildet under et lysmikroskop. Gram-positive bakterier ser lilla ut, fordi krystallfioletten er fanget i den tykke celleveggen. Gram-negative bakterier vil være rosa eller røde i fargen, fordi krystallfiolett skylles ut gjennom de tynne celleveggene, der det rosa motfargestoffet kommer inn.
- Hvis prøven er for tykk, kan resultatet være falskt positivt. Flekk en ny prøve hvis den viser alle grampositive bakterier, for å sikre at resultatet er riktig.
- Hvis du bruker for mye farge blekemiddel, kan resultatet være et falskt negativt. Flekk en ny prøve hvis den viser alle gramnegative bakterier, for å sikre at resultatet er riktig.
Trinn 3. Sammenlign resultatene du ser med referansebildet
Hvis du ikke vet hvordan bakterier ser ut, studerer du samlingen av referansebilder, vanligvis sortert etter form og Gram -flekk. Du kan også se online databaser på [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos og mange andre nettsteder. For å lette identifiseringen er det eksempler på bakterier som ofte oppstår eller er viktige for diagnosen, og som er klassifisert i henhold til deres Gram -status og form.
Trinn 4. Identifiser grampositive bakterier basert på deres form
Bakterier er videre klassifisert i henhold til deres form under mikroskopet, oftest som kokker (sfæriske) eller stenger (sylindriske). Her er noen eksempler på grampositive bakterier (lilla i fargen) i henhold til deres form:
- Gram positive kokker vanligvis stafylokokker (som betyr gruppekokker) eller streptokokker (som betyr kjedekokker).
- 'Grampositive stenger som Bacillus, Clostridium, Corynebacterium og Listeria. Stangbakterien Actinomyces spp. har vanligvis grener eller filamenter.
Trinn 5. Identifiser gramnegative bakterier
Gram-negative bakterier (rosa i fargen) er ofte klassifisert i tre grupper. Kokker er sfæriske i form, stenger er lange og tynne, mens koksidestenger er i mellom.
- Gram negative kokker Den vanligste er Neisseria spp.
- Gram-negative stenger f.eks. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas og mange andre. Vibrio cholerae kan sees på som en vanlig stamme eller en bøyd stilk.
- Gram-negative "coccoid" (eller "coccobacilli") stangbakterier f.eks. Bordetella, Brucella, Haemophilus og Pasteurella
Trinn 6. Sjekk nøye om resultatene er blandet
Noen bakterier er vanskelige å fargelegge nøyaktig, på grunn av sprøheten eller voksaktig natur i celleveggene. Disse bakteriene kan vise en blanding av lilla eller rosa i samme celle, eller mellom forskjellige celler i samme smøre. Bakterieprøver eldre enn 24 timer kan vise dette problemet, men det er også noen bakteriearter som er vanskelige å fargelegge i alle prøvetakingsalder. Disse bakteriene krever mer spesialiserte tester for identifisering, for eksempel syrerask flekker, observasjon i bakteriekultur, TSI-kulturmedier eller genetisk testing.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium og Propionibacterium spp. alle er grampositive bakterier, men er ofte ikke tydelig flekkete.
- Små, slanke bakterier som Treponema, Chlamydia og Rickettsia spp. vanskelig å flekke med Gram -metoden.
Trinn 7. Kast gjenværende forbruksvarer og utstyr
Denne avfallshåndteringsprosedyren varierer mellom laboratorier og avhenger av materialene som brukes. Vanligvis kastes væsken i fargebakken i flasker merket som farlig avfall. Bløtlegg objektglassene i 10% blekemiddeloppløsning, og kast dem deretter i en beholder for skarpe gjenstander.
Tips
- Husk at resultatene for Gram -flekker bare vil være gode hvis prøven er god. Det er viktig å informere pasientene slik at de kan gi en god prøve (f.eks. Forskjellen mellom spytting mot dyp hoste for å få en sputumprøve).
- Etanol reagerer saktere enn aceton som fargeblekkemiddel.
- Følg standard laboratorieforskrift for å ivareta sikkerheten.
- Bruk en kinnpinne for å øve, fordi den inneholder både grampositive og gramnegative bakterier. Hvis du bare ser en type bakterier, bruker du kanskje for lite eller for mye blekemiddel.
- Du kan bruke treklemmer for å sikre lysbildet.
Advarsel
- Aceton og etanol er brannfarlige stoffer. Acetonen fjerner oljen fra hendene, noe som gjør det lettere for huden din å absorbere andre kjemikalier. Bruk hansker og bruk dem forsiktig.
- Ikke la smøret tørke før du skyller av Gram -flekken eller mot flekker.
Hva trenger du
- Nettverksprøve
- Glassplate
- Pipetter
- Liten brannkilde, eller lysbildevarmer, eller metanol
- Vann
- Krystallfiolett
- Jod
- Farge blekemiddel, for eksempel alkohol eller aceton
- Safranin
